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全自動(dòng)WB工作站的操作步驟介紹

發(fā)布日期: 2023-08-23
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  免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting),是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè),可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。
  由于抗體僅與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合,因此一般只能看到一條清晰的帶,條帶的粗細(xì)對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)量。通過分析特定反應(yīng)的位置和強(qiáng)度,可以獲得目標(biāo)蛋白在給定細(xì)胞或組織勻漿中的表達(dá)信息。由于凝膠電泳的高分辨率和免疫的強(qiáng)特異性和高靈敏度,Western印跡分析可檢測(cè)低至1ng的靶蛋白。該方法廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫遺傳學(xué)等分子生物學(xué)領(lǐng)域。
  全自動(dòng)WB工作站操作步驟:
  1.準(zhǔn)備樣品
  1)制冰,準(zhǔn)備冰盒。
  2)配制細(xì)胞裂解液:根據(jù)細(xì)胞數(shù)量確定所需裂解液:50ul/六孔板一孔。
  裂解液配方:100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制劑混合物+1ul PMSF
  3)按實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備好細(xì)胞:去掉培養(yǎng)基,1×PBS洗3次(去掉培養(yǎng)基中的血清),每個(gè)孔(6孔板)加入適量的裂解液。迅速用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5ml管中,置于冰上20min,振蕩混合后,再置冰上10min。
  4)12,000g,4℃離心15min,收集上清至另一1.5ml管。
  5)取2.5ul樣品加22.5ul三蒸水稀釋,用于BCA法測(cè)蛋白濃度。
  6)其余樣品加5×Loading Buffer(按2.5mlBuffer/10ml蛋白)用95℃煮10分鐘,期間振蕩一次。
  7)直接上樣跑膠或者分裝-80°C長(zhǎng)期保存。
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